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無(wú)錫市熱啟動(dòng)Taq酶標(biāo)準(zhǔn)

疫苗:是指用物理或化學(xué)方法將致病微生物殺死或致弱而制成的一種無(wú)致病性、有免疫原性的制劑，或者是直接提取致病微生物的免疫原性蛋白或編碼免疫蛋白的基因，利用分子生物學(xué)技術(shù)制成的具有免疫原性而無(wú)致病性的制劑。目前的疫苗有病毒(細(xì)菌)死苗、病毒(細(xì)菌)活苗、亞單位苗、基因工程苗等。血清型:是指微生物學(xué)中種以下的一種分 型。因?yàn)槲⑸镌诜N內(nèi)有不同的抗原性，因此可分不同的抗原型或血清型。

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化驗(yàn)室診斷方法采用的檢測(cè)依據(jù)有以下幾種:①國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)以及農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn);②動(dòng)物疫病檢測(cè)的其他規(guī)范:③化驗(yàn)室自行設(shè)定的檢測(cè)方法。不管采用何種方法，都需要考慮化驗(yàn)室自身的條件及樣品類型，如在對(duì)偽狂犬病進(jìn)行診斷時(shí)，實(shí)驗(yàn)室有酶標(biāo)儀，沒(méi)有基因擴(kuò)增儀，在診斷時(shí)檢測(cè)人員可采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)進(jìn)行診斷。如果送檢樣品為血清，檢測(cè)人員則可以采用酶聯(lián)吸附試驗(yàn)，而不需要采用動(dòng)物接種試驗(yàn)與病毒分離鑒定方法。

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實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀，由熒光定量系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)組成，用來(lái)監(jiān)測(cè)循環(huán)過(guò)程的熒光。與實(shí)時(shí)設(shè)備相連的計(jì)算機(jī)收集熒光數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)通過(guò)開發(fā)的實(shí)時(shí)分析軟件以圖表的形式顯示。原始數(shù)據(jù)被繪制成熒光強(qiáng)度相對(duì)于循環(huán)數(shù)的圖表。原始數(shù)據(jù)收集后可以開始分析。實(shí)時(shí)設(shè)備的軟件能使收集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行正?；幚韥?lái)彌補(bǔ)背景熒光的差異。正?；罂梢栽O(shè)定域值水平，這就是分析熒光數(shù)據(jù)的水平。

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Taq酶的酶動(dòng)力與擴(kuò)增效率有關(guān)。一般熱啟動(dòng)Taq酶的酶動(dòng)力越強(qiáng)，PCR擴(kuò)增的指數(shù)增長(zhǎng)期越長(zhǎng)，‘S型’曲線更加典型，熒光信號(hào)值更高，而且更適合做多重PCR檢測(cè)。我們?cè)容^過(guò)多家公司的熱啟動(dòng)Taq酶，在國(guó)外品牌中，英國(guó)Bioline公司的熱啟動(dòng)Taq酶，酶動(dòng)力較好，可做4重PCR，等量起始模板CT30時(shí)的熒光信號(hào)值高。在國(guó)內(nèi)品牌中，BIOG熱啟動(dòng)Taq酶的指數(shù)期較長(zhǎng)，可做3重PCR，且擴(kuò)增曲線的‘S’型不受影響，其它的國(guó)產(chǎn)品牌一般只能支持2重反應(yīng)，在做3重反應(yīng)時(shí)，擴(kuò)增曲線低矮，熒光信號(hào)值較低，無(wú)典型擴(kuò)增曲線，結(jié)果很難判定。

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相對(duì)分子質(zhì)量為94的Taq DNA聚合酶的活性較高，大約為200000 U/mg，在合成DNA時(shí)有一個(gè)較高的適溫度75～80℃。Taq DNA聚合酶雖然在90℃以上合成DNA的能力有限，但高溫時(shí)仍比較穩(wěn)定。有實(shí)驗(yàn)證明，在92.5℃、95℃和97.5℃時(shí)，PCR混合物中的Taq DNA聚合酶分別經(jīng)130 min、40 min和5～6 min后，仍可保持百分之50左右的活性，其半衰期較長(zhǎng)。所以，在一個(gè)PCR預(yù)備試驗(yàn)中，每次循環(huán)時(shí)上限溫度為95℃處理20S，則循環(huán)50次后Taq DNA聚合酶仍可保持百分之65的活性，能夠保證實(shí)驗(yàn)的需要。

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在PCR反應(yīng)早期，產(chǎn)生熒光的水平不能與背景明顯地區(qū)別，而后熒光的產(chǎn)生進(jìn)入指數(shù)期、線性期和終的平臺(tái)期，因此可以在PCR反應(yīng)處于指數(shù)期的某一點(diǎn) 上來(lái)檢測(cè)PCR產(chǎn)物的量，并且由此來(lái)推斷模板初的含量。為了便于對(duì)所檢測(cè)樣本進(jìn)行比較，在real-time Q-PCR反應(yīng)的指數(shù)期，首先需設(shè)定一定熒光信號(hào)的域值，一般這個(gè)域值（threshold）是以PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào) （baseline），熒光域值的缺省設(shè)置是3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。如果檢測(cè)到熒光信號(hào)超過(guò)域值被認(rèn)為是真 正的信號(hào)，它可用于定義 樣本的域值循環(huán)數(shù)（Ct）。Ct值的含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。研究表明，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的 對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，因此只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣 品的起始拷貝數(shù)。