通遼市實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀應(yīng)用
發(fā)布時(shí)間：2024-07-13 01:13:41
通遼市實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀應(yīng)用
分子診斷的主要技術(shù)有核酸分子雜交、聚合酶鏈反應(yīng)和生物芯片技術(shù)。1.核酸分子雜交技術(shù) 具有一定互補(bǔ)序列和核苷酸單鏈在液相或固相中按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則締合成異質(zhì)雙鏈的過(guò)程，稱為核酸分子雜交。雜交的雙方是待測(cè)核酸序列和探針序列。應(yīng)用該技術(shù)可對(duì)特定DNA或RNA序列進(jìn)行定性或定量檢測(cè)。2.聚合酶鏈反應(yīng)（即Polymerase chain reaction，PCR）原理：PCR是模板DNA，引物和四種脫氧核糖核昔三磷酸（dNTP）在DNA聚合酶作用下發(fā)生酶促聚合反應(yīng)，擴(kuò)增出所需目的DNA。包括三個(gè)基本步驟：雙鏈DNA模板加熱變性成單鏈（變性）；在低溫下引物與單鏈DNA互補(bǔ)配對(duì)（退火）；在適宜溫度下TapDNA聚合酶催化引物沿著模板DNA延伸。3.生物芯片技術(shù)是近年發(fā)展起來(lái)的分子生物學(xué)與微電子技術(shù)相結(jié)合的核酸分析檢測(cè)技術(shù)。起初的生物芯片技術(shù)主要目標(biāo)是用于DNA序列測(cè)定、基因表達(dá)譜鑒定和基因突變體檢測(cè)和分析，所以又稱為DNA芯片或基因芯片技術(shù)。由于這一技術(shù)已擴(kuò)展至免疫反應(yīng)、受體結(jié)合等非核酸領(lǐng)域，出現(xiàn)了蛋白質(zhì)芯片、免疫芯片、細(xì)胞芯片、組織芯片等，所以改稱生物芯片技術(shù)更符合發(fā)展趨勢(shì)。
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分子診斷是當(dāng)代醫(yī)學(xué)發(fā)展的重要前沿領(lǐng)域之一，其核心技術(shù)是基因診斷，常規(guī)技術(shù)包括：（1）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）；（2）DNA測(cè)序（DNA sequencing）；（3）熒光原位雜交技術(shù)（FISH）；（4）DNA印跡技術(shù)（ DNA blotting ）；（5）單核苷酸多態(tài)性（SNP）；（6）連接酶鏈反應(yīng)（LCR）；（7）基因芯片技術(shù)（gene chip）。
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在動(dòng)物疫病診斷中，化驗(yàn)室的操作較為關(guān)鍵，對(duì)診斷的結(jié)果有直接的影響。但是，在當(dāng)前實(shí)驗(yàn)室操作中還存在一-些問(wèn)題，如檢測(cè)操作中、檢測(cè)報(bào)告中未填寫、不開(kāi)具《檢測(cè)委托書》等這些問(wèn)題的存在嚴(yán)重影響動(dòng)物疫病的診斷，不利于動(dòng)物疫病的防控。因此，在今后工作中，需要對(duì)相關(guān)工作制度進(jìn)行不斷地完善，促使化驗(yàn)室的操作更加規(guī)范化、科學(xué)化;加強(qiáng)對(duì)實(shí)驗(yàn)室人員的專業(yè)培訓(xùn)，提高其操作水平。只有這樣才能提高動(dòng)物疫病檢測(cè)的準(zhǔn)確性，為我國(guó)的動(dòng)物疫病防控工作做好鋪墊。
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做好經(jīng)費(fèi)支持。按照《財(cái)政部、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部關(guān)于修訂印發(fā)農(nóng)業(yè)相關(guān)轉(zhuǎn)移支付資金管理辦法的通知》（財(cái)農(nóng)〔2020〕10號(hào)）要求，對(duì)國(guó)家確定的強(qiáng)制免疫病種，財(cái)政切塊下達(dá)補(bǔ)助資金，統(tǒng)籌支持各省份開(kāi)展強(qiáng)制免疫、免疫效果監(jiān)測(cè)評(píng)價(jià)、疫病監(jiān)測(cè)和凈化、人員防護(hù)，以及實(shí)施強(qiáng)制免疫計(jì)劃、購(gòu)買防疫服務(wù)等。開(kāi)展宣傳培訓(xùn)。各省份要充分利用各類媒體，加大國(guó)家動(dòng)物疫病強(qiáng)制免疫政策的宣傳力度，提升養(yǎng)殖者自主免疫意識(shí)，提高科學(xué)養(yǎng)殖和防疫水平。要制定動(dòng)物免疫病種的免疫培訓(xùn)方案，定期開(kāi)展技術(shù)培訓(xùn)，指導(dǎo)相關(guān)人員科學(xué)開(kāi)展免疫，加強(qiáng)個(gè)人防護(hù)。
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傳染病的有關(guān)概念傳染:傳染是在- -定的外界條件下，動(dòng)物機(jī)體與侵入體內(nèi)的病原微生物相互斗爭(zhēng)所表現(xiàn)的不同程度的感受過(guò)程。病原微生物在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)一定部位定居、繁殖，引起機(jī)體產(chǎn)生- - 系列病理反應(yīng)的過(guò)程。呈現(xiàn)出一- 定的臨床癥狀的傳染稱為顯性傳染。反之，如果動(dòng)物不顯臨床癥狀，稱為隱性傳染。傳染病:凡是由病原微生物引起，具有--定的潛伏期和臨床表現(xiàn)，并具有傳染性的疾病稱為傳染病。敗血癥:病原體在機(jī)體的局部感染后，不斷繁殖并進(jìn)人血液，在f血液中繼續(xù)繁殖，產(chǎn)生毒素，引起各實(shí)質(zhì)器官的嚴(yán)重病變與全身反應(yīng)的綜合征。
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在PCR反應(yīng)早期，產(chǎn)生熒光的水平不能與背景明顯地區(qū)別，而后熒光的產(chǎn)生進(jìn)入指數(shù)期、線性期和終的平臺(tái)期，因此可以在PCR反應(yīng)處于指數(shù)期的某一點(diǎn) 上來(lái)檢測(cè)PCR產(chǎn)物的量，并且由此來(lái)推斷模板初的含量。為了便于對(duì)所檢測(cè)樣本進(jìn)行比較，在real-time Q-PCR反應(yīng)的指數(shù)期，首先需設(shè)定一定熒光信號(hào)的域值，一般這個(gè)域值（threshold）是以PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào) （baseline），熒光域值的缺省設(shè)置是3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。如果檢測(cè)到熒光信號(hào)超過(guò)域值被認(rèn)為是真 正的信號(hào)，它可用于定義 樣本的域值循環(huán)數(shù)（Ct）。Ct值的含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。研究表明，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的 對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，因此只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣 品的起始拷貝數(shù)。